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文 | 追問 NextQuestion
在《我在島嶼讀書》中，作家們看到海中的燈塔，不禁想到弗吉尼亞 · 伍爾夫的小說《到燈塔去》，并折服于她所寫的 " 她經常感覺到，她不過是一塊吸飽了人類各種各樣感情的海綿罷了 "。而科學家們看到這樣的情景感興趣的是，人們調用這些記憶時，大腦進行的一系列神經活動，如神經元内動作電位的變化、AMPA 受體的上膜、相關基因的表達等，以及如何直觀地從多尺度對這些活動進行檢測。
2023 年 8 月 18 日，天橋腦科學研究院（Tianqiao and Chrissy Chen Institute，TCCI）和哥倫比亞大學神經技術中心（NTC）、多諾斯蒂亞國際物理中心（DIPC）聯合舉辦了在線學術會議NanoNeuro 2023。本次會議上，來自哈佛大學的 Adam E. Cohen 教授以" 映射記憶的分子工具（Molecular tools for mapping memories）"爲題，從高速生物電動力學、突觸可塑性、全腦範圍内基因表達的改變三個方面介紹了其實驗室近期圍繞記憶過程（不局限于記憶的研究）所開發的一系列分子工具。
捕捉樹突樹上的 " 星星 "
神經元的樹突參與傳遞兩個方向的神經信息。一個方向是從樹突到胞體，樹突可以整合來自突觸的輸入信息，确定胞體動作電位時間；另一方向是從胞體到樹突。樹突也可以整合來自胞體的反向傳播動作電位和突觸輸入信息一起調控突觸強度的變化（也就是常說的突觸可塑性）。而在任一方向上傳播的電信号都會遇到一系列不同的離子通道，這些離子通道會賦予樹突以非線性和曆史依賴性的動作電位。
那麽，樹突是如何執行突觸輸入信息整合和動作電位反向傳播這些獨特任務的呢？更普遍地說，樹突的生物物理學特征和樹突雙向信息處理功能之間的關系是什麽？
人們希望可以在任意空間和時間範圍内對神經元施加刺激，然後追蹤整個樹突樹電壓的動态變化過程來一探究竟。基于此，Adam E. Cohen 教授團隊通過整合靶向光遺傳學刺激、熒光電壓指示器和結構照明顯微鏡技術，開發了一種可以測量整個樹突樹電壓變化的工具。該工具可對光敏感通道蛋白 CheRiff 和化學遺傳電壓指示蛋白 Voltron2 進行化學修飾，提高其在樹突中的表達。
爲了驗證該工具的可行性，他們在小鼠海馬 CA1 錐體神經元中構建了上述兩個基因的雙順反子表達載體，并制備了急性腦片，通過以下步驟制成了高時空分辨率圖像。
1. 通過雙光子顯微鏡制作高分辨率的結構圖像。 2. 将光遺傳學刺激和結構化照明的高速電壓成像（圖 1，a-b）技術相結合。 3. 統籌結構和功能數據，制成高時空分辨率圖像。
這種圖像可以顯示反向傳播動作電位的時間和振幅（圖 1，c-e）。同時也能夠以 25μs 的分辨率揭示了動作電位波面運動的細節（圖 1，f）。
▷圖 1：用全光學電生理技術映射鋒電位反向傳播。圖源：參考文獻 [ 1 ]
在後續的實驗中，他們發現動作電位在遠端樹突中的曆史依賴性傳播是由局部生成的鈉離子鋒電位（dSpike）驅動的。另外，樹突的去極化會引起 dSpike 的瞬時傳播。再者，dSpike 與突觸輸入的整合将觸發 NMDA 受體依賴性高原電位。上述實驗結果結合數值模拟，有望在樹突的生物物理學特征與突觸可塑性之間建立知識連接。
【注】
樹突（dendrite）：是神經元解剖結構的一部分，是從神經元胞體發出的多分支突起。樹突爲神經元的輸入通道，其功能是将自其他神經元所接收的動作電位（電信号）傳送至細胞本體。其他神經元的動作電位借由位于樹突分支上的多個突觸傳送至樹突上。樹突在整合這些突觸所接收到的信号、以及決定此神經元将産生的動作電位強度上，扮演了重要的角色。
動作電位的反向傳播（back-propagating action potential，bAP）：該概念是相較于動作電位的正向傳播而言的。動作電位的正向傳播即動作電位通常由神經元軸突近胞體端處的軸突起始段啓動，沿着軸突向突觸前末梢傳遞；動作電位的傳播方式具有雙向性，除了從胞體到軸突末梢的正向傳播以外，還可以從胞體向樹突末梢的方向反向傳播。動作電位的反向傳播是樹突樹神經元信号整合和突觸可塑性的關鍵。
樹突整合原則（dendritic integration rule）：樹突是神經元的主要接收元件。它們的作用就像天線，從成千上萬（有時是數萬甚至數十萬）的突觸前輸入中獲取信息。樹突樹複雜的幾何結構，以及其主動和被動特性，使神經元能夠對其輸入的信息進行一系列複雜計算。了解單個神經元如何整合它們接收到的數千個突觸輸入對于理解大腦如何工作至關重要。
關聯可塑性原則（associative plasticity rule）：當長時程增強（LTP）誘導高頻刺激應用于另一個獨立強輸入時，在激活的輸入中誘導突觸傳遞效能的長期持續增加。在弱輸入中，高頻刺激（例如 100 Hz 持續 1 s）常不能誘發 LTP; 然而，當弱輸入與另一獨立強輸入的高頻刺激同時被刺激時，弱輸入也可以表現出 LTP。這種類型的 LTP 被稱爲 " 關聯 LTP"。
dSpike：爲 dendritic spike（樹突鋒電位）的縮寫。在本文中，無論在什麽位置對神經元施加刺激，鋒電位總是從神經元胞體開始，然後傳回樹突。在胞體處的鋒電位具有相似的波形，但遠端樹突處的鋒電位卻顯示出不同的 bAP 傳播基序。
給新上膜的受體換個顔色
突觸強度的改變是學習和記憶的重要組成部分。但哪些突觸代表哪些記憶，以及突觸強度的變化與其他記憶标記物（如即早期基因的表達）之間的關系，目前尚不明确。爲了回答這些問題，Adam E. Cohen 教授團隊開發了一種新技術，即神經元細胞外蛋白質表面标記（EPSILON），通過用染料标記細胞膜表面 AMPA 受體，繪制神經元中特定時間窗内的突觸強度變化圖譜。
以往的研究表明，神經元突觸中 AMPA 受體的密度是突觸強度的重要表征。在記憶形成過程中，儲存在神經元内囊泡中的 AMPA 受體會與突觸後膜融合，輸送到細胞膜上。于是，他們将标記 HaloTag（HT）蛋白融合到 GluA1 的 N 末端（圖 2，A），并在神經元中表達 HT-GluA1，然後通過直接注射 HaloTag 配體（HTL）染料（圖 2，B），與神經元表面的 HT-GluA1 受體結合。過一段時間後，添加不同顔色的染料來标記新暴露在細胞膜表面的 HT-GluA1。因此，不同時間暴露在細胞膜表面的 HT-GluA1 将會被标記爲不同的顔色。如果動物處于學習狀态下（圖 2，C），這一技術将會對動物學習記憶過程前後膜上 HT-GluA1 的變化進行溯源。最後，使用離體多色成像，将展示大量腦組織和不同腦區 AMPA 受體胞吐過程的單突觸分辨率圖譜。
▷圖 2：EPSILON 标記新上膜的 AMPA 受體。圖源：參考文獻 [ 5 ]
海馬區對空間記憶形成和存儲是必要的，但目前對海馬印迹或記憶痕迹的物理學本質仍不清楚，突觸水平和細胞水平記憶編碼之間的關系也尚不清晰。Adam E. Cohen 教授團隊基于 EPSILON 技術，繪制了情境恐懼條件反射下，海馬 CA1 錐體神經元的突觸可塑性和 cFos 基因表達的圖譜。相較于對照組，在情景恐懼條件反射的小鼠中，他們發現突觸可塑性程度與 cFos 基因表達水平密切相關。這一發現提示了 cFos 基因表達與記憶印迹相關的突觸分子機制。他們還觀察到，與遠端突觸相比，神經元胞體周圍的突觸可塑性更強。
上述實驗表明，基于 AMPA 受體的 EPSILON 技術是研究突觸可塑性的有力工具。同時 EPSILON 技術也有望應用于标記其他跨膜蛋白。
AMPA 受體：α- 氨基 -3- 羟基 -5- 甲基 -4- 異噁唑受體（也稱爲 AMPAR）是一種谷氨酸能離子型跨膜受體（iGluR），其介導中樞神經系統中的快速興奮性突觸傳遞。在突觸後膜中動态表達，與長時程增強、長時程抑制等生物過程的觸發和維持有關，參與調節學習記憶活動。
空間記憶：對環境信息和空間方位的記憶。
情境恐懼條件反射：從操作的角度來看，情境恐懼條件反射可能是最簡單的學習形式。将齧齒動物（小鼠）引入新的實驗環境中，幾分鍾後，一次或多次電擊其足部。随後，再次返回新環境時，小鼠将依然表現出特征性恐懼行爲，即使不再被電擊。
即早期基因（Immediate-early genes，IEG）：細胞中一組受到外部刺激後迅速并短暫激活的基因，這些基因的激活不需要其他基因的表達。與之相對的是，一些下遊的、需要即早期基因表達産物激活的基因。在神經科學中，即早期基因被廣泛用作神經元可塑性的标記物。
在神經元内嵌入彩色 " 年輪 "
生物學長期發展目标之一是繪制生物體内基因的動态表達圖譜，這些圖譜将有助于揭示大腦活動、胚胎發育或疾病進展等重要生物學過程中基因的時空表達特征。細胞是最小的生命系統，如何實現在細胞内記錄特定基因表達的時間窗，也是 Adam E. Cohen 教授團隊好奇的重要科學問題。在自然界中，樹木通過一圈又一圈的年輪，記錄時間的流逝。那麽，在細胞中是否可以同樣構建出類似年輪的分子時鍾，來映射細胞内特定事件的時間窗呢？爲此，他們研發出了在單個細胞内，通過構建蛋白質組裝體來記錄細胞内曆史的分子工具。
這個工具主要由三個部分組成（圖 3，a-d）。
首先，一個蛋白質支架。這種蛋白質支架可以在哺乳動物細胞中表達，由單鏈多肽組裝形成，晶體結構已知，其延伸不會幹擾細胞正常的生理過程，以及可以攜帶熒光标記并且所攜帶的熒光标記不會破壞蛋白質支架的整體結構。通過大量的篩選，Pak4 激酶催化結構域與其抑制劑 Inka1 的氨基酸 iBox 結構域所形成的融合蛋白是實驗中理想的蛋白質支架的元件（以下稱爲 iPAK4），其可以在細胞内穩定地組裝成杆狀晶體。
其次，一種可以将蛋白質支架的長度與外部世界時間校準的方法。使用 HT（HaloTag）與 iPAK4 的融合蛋白，可以構建基準時間戳。不同顔色的 HT 配體染料交替注射可以産生顔色邊界，其位置将對應已知的時間。
最後，可以穩定地結合到支架中，具有轉錄活性的 eGFP 熒光報告基因。通過測量蛋白質支架上 eGFP 标記相對于基準時間戳的位置，可以大緻推斷感興趣的基因轉錄的時間。
随後，Adam E. Cohen 教授團隊在 HEK 細胞和小鼠海馬神經元中，對 cFos 基因的啓動子的轉錄激活進行了記錄，證明了該系統的有效性。
▷圖 3：胞内 iPAK4 蛋白支架。圖源：參考文獻 [ 6 ]
工欲善其事，必先利其器。人們對世界的認識，離不開日新月異的技術的發展。Adam E. Cohen 教授團隊研發的一系列分子工具，将有助于開展對記憶等生物學過程中神經活動的監測。未來，神經技術的突破也将助力大腦奧秘的揭露。
參考文獻
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