2024 年 2 月 21 日，清華大學 / 西湖大學施一公團隊在PNAS 在線發表題爲 "Dark and Dronc activation in Drosophila melanogaster" 的研究論文，該研究報道了一個自抑制的 Dark 單體和一個單層的多聚體 Dark/Dronc 複合物的冷凍電鏡結構。
生化分析表明自動抑制的 Dark 在與 Dronc 結合時發生寡聚，這足以激活 Dark 和 Dronc。相反，先前觀察到的雙環 DARK 細胞凋亡可能代表一種非功能性或 " 通路外 " 構象。這些發現擴大了對果蠅細胞凋亡分子機制的認識。
2024 年 2 月 12 日，堪薩斯大學 Michael S. Wolfe 及清華大學 / 西湖大學施一公等多團隊合作在Cell Reports 在線發表題爲 "Familial Alzheimer mutations stabilize synaptotoxic γ -secretase-substrate complexes" 的研究論文，該研究發現FAD 突變破壞了 γ - 分泌酶在 APP 底物 C99 多步驟加工中的初始蛋白水解事件。冷凍電子顯微鏡顯示，在過渡狀态下，底物模拟物捕獲了 γ - 分泌酶，這種結構與分子動力學模拟捕獲的活化酶 - 底物複合物一緻。在矽模拟和在纖維素熒光顯微鏡支持穩定酶 - 底物複合物的 FAD 突變。秀麗隐杆線蟲中 C99 和 / 或早老素 -1 的神經元表達僅在 FAD 突變的轉基因中導緻突觸丢失。設計的穩定酶 - 底物複合物和阻斷 A β 産生的突變同樣導緻突觸喪失。總的來說，這些發現暗示了在 FAD 發病機制中，γ - 分泌酶裂解底物的停滞過程，而不是産物。
細胞凋亡在後生動物中是必不可少的。保守的細胞凋亡調控途徑已經在一些模式生物中被描述出來，包括秀麗隐杆線蟲、黑腹果蠅和哺乳動物。一般來說，細胞凋亡的發生涉及啓動物和效應物 caspases 的級聯蛋白水解激活。啓動物 caspases 的自催化激活需要一個多聚體的 adaptor 複合物。通常被稱爲凋亡體。效應半胱天冬酶通過啓動物半胱天冬酶的直接蛋白水解裂解被激活。
在黑腹果蠅中，啓動物 caspase Dronc 被果蠅凋亡抑制劑 ( DIAP ) 介導的泛素化抑制。在凋亡刺激下，DIAP 被促凋亡蛋白 Reaper、Hid 和 Grim ( RHG ) 拮抗。通過各自的 caspase 募集域 ( CARDs ) 之間的保守相互作用，在 Dark 的促進下，Dronc 經曆了自催化裂解。與哺乳動物啓動物 caspase-9 不同，caspase-9 仍然與 Apaf-1 凋亡體相關，作爲全酶發揮作用，激活的 Dronc 與 Dark 凋亡體分離，并自主切割下遊效應 caspase DrICE。
自抑制 Dark ( D333A ) 單體的冷凍電鏡結構（圖源自 PNAS ）
在非凋亡條件下，Dark 作爲一種自抑制單體存在。與哺乳動物同源蛋白 Apaf-1 不同，它需要 dATP 和細胞色素 c ( Cyt c ) 進行寡聚，而 Dark 激活不依賴于 Cyt c。在 dATP 存在的情況下，16 個 Dark 原體組裝成一個雙環複合物，這是 Dark 凋亡體的冷凍電鏡結構所揭示的。體外生化研究表明，即使在沒有外源核苷酸的情況下，Dronc-CARD 或全長 ( FL ) Dronc 酶原也足以誘導暗寡聚化以激活 Dronc。
有趣的是，Dark 與 Dronc-CARD 結合的複合體也以雙環的形式存在，16 個 CARD 被兩個 Dark 環夾在中間，每個圓環包含 8 個 Dark 原體。此外，據報道，在激活後，Dark 和 Dronc 形成了一個單一的環，盡管其結構仍有待闡明。盡管取得了這些進展，但 Dark 和 Dronc 被激活的分子機制仍然知之甚少。特别是，Dark 和 Dark/Dronc-CARD 雙環的功能尚不清楚。
Dark 的工作模型促進了 Dronc 的激活（圖源自 PNAS ）
爲了解決這些問題，該研究解決了自動抑制的 Dark 的結構，并推斷其與低聚物 Dark 的比較可以解釋在 Dronc-CARD 或 FL-Dronc 存在時 dATP 對于 Dark 寡聚化的可調性。研究人員還測定了 FL-Dronc 存在下的 Dark 的結構，以了解 Dark 促進 Dronc 激活的分子基礎。
通過結構分析，該研究發現與 Dark 寡聚化相關的構象變化與 Apaf-1 相似。Dark 在 FL-Dronc 的存在下組裝成一個未密封的環，很像螺旋。生化研究表明，先前表征的雙環 Dark 細胞凋亡可能代表一種通路外狀态。Dark 和 Dronc 之間的相互作用本身就足以激活兩種蛋白質。這些發現既證明了進化保守，也證明了不同生物體中細胞凋亡的關鍵偏差。
參考消息：
https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2312784121
